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黃曲霉毒素親和柱操作步驟簡介

更新時(shí)間:2022-02-15      點(diǎn)擊次數(shù):1602
  黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是食品中產(chǎn)泛存在的一種高致癌性真菌毒素,是Asperilus flavus和Asperillus parasiticus的二次代謝產(chǎn)物,黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)后在體內(nèi)經(jīng)羥基化而形成的產(chǎn)物,主要存在于動(dòng)物的可食部分,如乳、肝、蛋類等,其中以乳形態(tài)較為常見。是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性較大的真菌毒素。它可通過多種途徑污染食品和飼料,直接或間接進(jìn)入人類食物鏈,威脅人類健康和生命安全,對(duì)人體及動(dòng)物內(nèi)臟器官尤其是肝臟損害嚴(yán)重,該毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物,普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中。鑒于黃曲霉毒素對(duì)人類的巨大危害性,我國對(duì)其在食品中的含量作了嚴(yán)格規(guī)定,其中,乳制品中黃曲霉毒素允許量為5ug/kg(即5ppb)。
  黃曲霉毒素親和柱的功能基于抗原與抗體間可逆的特異性結(jié)合反應(yīng),使其可從復(fù)雜樣品基質(zhì)中特異性地回收目標(biāo)化合物。上樣后,柱中以共價(jià)鍵形式偶聯(lián)在凝膠上的抗體會(huì)與抗原(即目標(biāo)化合物)特異性結(jié)合,雜質(zhì)不會(huì)被結(jié)合,大部分隨樣品溶液流出小柱。通過淋洗的方式除去小柱內(nèi)剩余雜質(zhì)后,使用純甲醇或其他洗脫液(根據(jù)對(duì)應(yīng)產(chǎn)品說明書選擇)進(jìn)行洗脫即可得到潔凈的目標(biāo)化合物溶液,可直接用于后續(xù)檢測。
  黃曲霉毒素親和柱操作步驟簡介:不同標(biāo)準(zhǔn)樣品的提取不太一樣,以國標(biāo) GB/T5009.22-2016 方法固體樣品為例
  1.提取樣品:粉碎、稱重5g樣品;用甲醇/水(70/30V/V)混合物將樣品高速混勻3分鐘。
  2.過濾:將提取的樣品槽紋濾紙或普通濾紙過濾。準(zhǔn)確移取 8.0mL 濾液并加入 42.0mL1%Tween-20 PBS 或1%TritionX-100PBS 稀釋,用玻璃纖維濾紙過濾,至濾液澄清,量取 25mL濾液備用。
  3.吸附、淋洗:將免疫親和柱連接于 50.0mL 玻璃注射器下。準(zhǔn)確將處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中, 調(diào)節(jié)下滴速度,控制樣液以 1mL / min~3mL / min 的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后(注:不要用空氣吹出殘留的液體,防止下一步出現(xiàn)堵柱子的現(xiàn)象) ,往注射器筒內(nèi)加入 2× 10mL 水,以 2mL / min~4mL /min 穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后,用真空泵抽干親和柱。 準(zhǔn)確加入 1.0mL 色譜級(jí)甲醇洗脫, 流速為 1mL/min~2mL/min(1 滴/秒),收集全部洗脫液于玻璃試管中。并收集于HPLC進(jìn)樣小瓶中。
  4.測定:HPLC直接進(jìn)樣,在經(jīng)過柱分離后,被UVD光化學(xué)衍衍生器衍生化,被熒光檢測器記錄各種黃曲霉毒素的濃度。



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